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La selezione ovocitaria nella fecondazione in vitroA cura del Dott. Francesco Bertocci (Responsabile Laboratorio PMA - Chianciano Salute)In questa pagina è riportata una versione semplificata da me redatta. Qualora siate interessati a visionare la versione originale del lavoro potete cliccare sul seguente link per scaricare il relativo file pdf: versione originale (Dott. G.M. Lentini)L'entrata in vigore della legge 40/2004 sulla Procreazione Medicalmente Assistita ha portato in primo piano l'importanza di una accurata selezione ovocitaria nell'ambito delle procedure di fecondazione in vitro. Prima di tale legge era infatti possibile selezionare gli embrioni da trasferire in utero dal pool di embrioni ottenuti dall'inseminazione di un certo numero di ovociti, crioconservando gli embrioni sopranumerari. Attualmente ciò non è più possibile in quanto tutti gli embrioni prodotti devono essere contemporaneamente trasferiti in utero. Inoltre non è possibile produrre più di tre embrioni per ciascun ciclo, ciò di conseguenza vuol dire che non è possibile utilizzare più di tre ovociti. Per tale motivo, risulta evidente l'importanza assunta dalla accurata selezione ovocitaria, in quanto solo l'utilizzo di un ovocita di ottima qualità potrà costituire un elemento predisponente al fine di ottenere embrioni di buona qualità che abbiano il massimo delle possibilità di impianto e quindi di esito in una gravidanza evolutiva. Ovociti immaturi o di scarsa qualità non saranno fertilizzati in vitro oppure daranno origine ad embrioni con scarso potenziale d'impianto. IE’ ormai noto che per ottenere una buona qualità delle cellule uovo è importante:
Cenni di OvogenesiLa prima fase della riproduzione sessuale è la gametogenesi, il processo che porta alla formazione di ovociti e spermatozoi. In uno stadio precoce dello sviluppo embrionale le cellule germinali primordiali migrano verso le gonadi (cioè verso i testicoli e le ovaie). Qui le cellule germinali, che a questo punto prendono il nome di ovogoni, si dividono mediante una serie di divisioni mitotiche. In pratica da una cellula madre derivano due cellule figlie le quali hanno lo stesse identiche caratteristiche della cellula madre e, in particolare lo stesso numero di cromosomi (cioè 46 cromosomi). Prima della nascita queste cellule terminano la loro divisione mitotica ed iniziano la divisione meiotica. La divisione meiotica differisce dalla divisione mitotica in quanto da una cellula madre originano due cellule figlie che però hanno solo 23 cromosomi ciascuna (corredo cromosomico aploide).
Nella donna la fase di proliferazione mitotica degli ovogoni termina prima della nascita dopodiché si ha la prima divisione meiotica che genera gli ovociti primari. Il periodo della crescita dell’ovocita è generalmente abbastanza lungo ed è caratterizzato da un aumento sostanziale di dimensioni. L’oocita, nonostante abbia raggiunto all’interno del follicolo antrale (cioè del follicolo di dimensioni minime) l’abilità a riprendere la divisione nucleare, mantiene comunque la condizione di arresto meiotico. Durante un normale ciclo mestruale si hanno delle modificazioni dei livelli degli ormoni sessuali. In particolare, a partire dal primo giorno delle mestruazioni (giorno 1 del ciclo) si ha una progressiva crescita dei livelli di ormone follicolostimolante (FSH). Nei giorni successivi si ha anche un crescita progressiva ma più lenta dei livelli di ormone luteotropo (LH) che raggiungono un picco intorno al 14° giorno del ciclo, questo picco dei livelli di LH, detto "picco preovulatorio" agisce a livello del follicolo ovarico e dell'ovocita sbloccando la condizione di arresto meiotico ed innescando quindi il processo di maturazione ovocitaria e nello stesso tempo avviando il follicolo verso l'evento ovulatorio. Il processo di maturazione ovocitaria è un processo di notevole importanza in quanto un ovocita maturo deve essere in grado di rispondere all'entrata dello spermatozoo innescando alcuni processi che impediscono l'ingresso ad ulteriori spermatozoi (polismermia), consentono l'attivazione dello spermatozoo entrato e le modificazioni del suo nucleo che poi permettaranno l'unione del DNA maschile con quello femminile. Valutazione della maturità ovocitariaLa corretta valutazione della maturità ovocitaria al momento del pick-up è determinante per il processo di fertlizzazione e successivo sviluppo. Errate valutazioni della qualità ovocitaria possono condurre a tempi di inseminazione non appropriati e risultare in fertilizzazioni mancate o anormali. Gli ovociti che sono stati inseminati prematuramente prima cioè della fase di metafase II, non hanno ancora iniziato quei processi che conducono alla decondensazione della cromatina nucleare dello spermatozoo (cioè del suo DNA) impedendo di fatto la fertilizzazione. Altre volte gli ovociti possono risultare fertilizzati in modo anormale. La valutazione morfologica degli ovociti si effettua dopo la fine del pick-up con uno strumento detto stereomicroscopio il quale deve avere caratteristiche tecniche di buona risoluzione e deve essere dotato di piastra riscaldata per evitare oscillazioni della temperatura. Dagli innumerevoli protocolli di stimolazione farmacologia si ottengono ovociti di vario aspetto e maturità; l’esperienza ci suggerisce che ogni ovocita dovrebbe essere valutato e trattato individualmente per ottimizzare le possibilità di gravidanza della paziente. Fino ad oggi non sono ancora state sviluppate metodiche biochimiche attendibili per fornire accurate e rapide informazioni riguardanti lo stadio di maturazione degli ovociti prelevati, quindi la diretta osservazione al microscopio rimane ancora il migliore strumento a disposizione degli embriologi. Circa l’80% degli ovociti recuperati dal liquido follicolare sono di qualità soddisfacente e in metafase II, il 10% hanno già cominciato il processo di atresia e il restante 10% sono immaturi. La corretta identificazione della maturità nucleare e la caratterizzazione della sua struttura interna (cioè del citoplasma) è resa difficile dalla presenza di cellule che sono adese alla parete esterna dell'ovocita dette cellule del cumulo ooforo e della corona radiata. Per la IVF tradizionale il complesso cumulo-ovocita viene sospeso in una piastra petri con circa 1 ml di terreno, questo accorgimento permette l’espansione del cumulo per una migliore visione del citoplasma,della zona pellucida e dello spazio perivitellino. Per la ICSI il cumulo e le cellule della corona sono di norma rimosse consentendo una visione perfetta dell’ovocita privo delle sue cellule accessorie. Storicamente la maturità ovocitaria è stata valutata dall’aspetto del cumulo ooforo e delle cellule che circondano l’ovocita al momento della raccolta. Durante il periodo pre-ovulatorio la morfologia delle cellule del cumulo e della corona subisce modificazioni sostanziali; la dispersione delle cellule del cumulo (diminuzione della densità cellulare) è infatti causata dall’accumulo di acido ialunorico nella matrice cellulare e dalla scomparsa dei legami che tengono strettamente saldate tali cellule l'una all'altra. Gli ovociti che possiedono un cumulo abbondante ed espanso con le cellule della corona radiata disposte regolarmente attorno alla zona pellucida sono definiti maturi; la presenza invece di un cumulo non-espanso con strati densi di cellule della corona è un segno dello stato intermedio della maturità e, infine, il cumulo assente definisce gli ovociti come immaturi (Veeck, 1991). Tuttavia l’espansione del complesso cumulo-ovocita non è sempre correlata direttamente con la maturità ovocitaria, diversi studi hanno riportato un’asincronia tra la morfologia del cumulo e della corona e la maturita’ nucleare (Mahadevan et al.,1990; Hammitt et al.,D.,1993; Greenblatt et al., 1995). E’ ben noto del resto che l’espansione del cumulo è gradualmente dipendente dall’ormone FSH nei cicli naturali, mentre nei cicli indotti farmacologicamente l’ aspetto del cumulo non è un indice sempre realistico. L’avvento della tecnica ICSI ha permesso una determinazione più esatta del livello di progressione meiotica e quindi della maturità ovocitaria. L.Veeck (1991) ha stabilito uno score di qualità ovocitaria basato sul fatto che solamente gli ovociti in metafase II caratterizzati da vescicola germinale non visibile e primo globulo polare visibile, possono essere utilizzati per la microiniezione.
Al momento del pick-up molti embriologi valutano sia la maturità nucleare dell’ovocita che la morfologia del complesso cumulo-ovocita usando una scala di gradi per la maturità nucleare e una per la morfologia (1-eccellente,2-buono,3-mediocre,4-scarso). Ad esempio quando un ovocita mostra un cumulo ed una corona espansi, un citolplasma chiaro ed omogeneo ed un globulo polare non frammentato potremmo attribuire uno score di 3-1 (maturo-eccellente). Questo sistema dovrebbe provvedere a fornire informazioni efficaci sul timing di inseminazione corretto, sulla qualità del protocollo di stimolazione utilizzato e quindi sul valore diagnostico e prognostico della qualità ovocitaria. Valutazione del fuso mitotico: il polscopioDurante la divisione meiotica i cromosomi dell'ovocita si allineano al centro di una struttura fatta a forma di fuso detta appunto "fuso meiotico" formata da piccoli tubuli di natura proteica detti microtubuli. L’integrità del fuso meiotico è necessaria per garantire la correttezza della sequenza di eventi che completano la meiosi e la fertilizzazione. I microtuboli del fuso dell’ovocita tuttavia sono estremamente sensibili a modificazioni chimiche e fisiche che possono intervenire durante la loro manipolazione. Anche i parametri fisiologici, come l’età materna avanzata e l’ageing in vitro dopo il prelievo possono danneggiare le fibre del fuso che possono condurre alla formazione di embrioni aneuploidi. Quindi l’integrità del fuso meiotico, che controlla i movimenti dei cromosomi durante la meiosi, è un fattore fondamentale per il successivo sviluppo embrionale. Recentemente è stata messa a punto una tecnica che permette di visualizzare la posizione del fuso meiotico e quindi di evitare di danneggiare le fibre del fuso durante la microiniezione (ICSI). Si tratta di un sistema di microscopia a luce polarizzata accoppiata ad un software di gestione di immagini che permette la visualizzazione del fuso meiotico (Polscope). Dato che l’utilizzo del Polscopio non interferisce in alcun modo con la vitalità ovocitaria l’analisi del fuso meiotico è un nuovo ed importante indicatore della qualità e maturità ovocitaria che può chiarire importanti aspetti della ICSI e fornire un parametro supplementare per la delicata scelta degli ovociti da utilizzare.
Ulteriori studi hanno messo in evidenza altri elementi di valutazione della qualità ovocitaria basati sia su indagini biochimiche (valutazione dei livelli di alcune sostanze) che su indagini ultrastrutturali (analisi del globulo polare). Nel complesso quindi l'analisi della "qualità" ovocitaria si è posta sempre più al centro dell'attenzione nell'esecuzione delle tecniche di fecondazione in vitro al fine di poter sempre più incrementare le proabilità di gravidanza. Al riguardo è opportuno sottolineare come la presenza di ovociti dismorfici si sia dimostrata correlata ad un più elevato tasso di aborto precoce. Per concludere quanto finora esposto pone in evidenza come un accurato studio della qualità ovocitaria rappresenti ad oggi un aspetto di fondamentale importanza nella corretta esecuzione delle procedure di fecondazione in vitro al fine di garantire la massima probabilità di gravidanza evolutiva nelle coppie costrette a ricorrere a tali metodiche.
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